LA DISSECTION ULTIME DES GENES ET LEUR RECOMBINAISON IN VITRO.

1 CARTOGRAPHIE A HAUTE RESOLUTION

1.1 OBTENTION DE MOLECULES D'ADN HOMOGENES

Comme on l'a vu au chapitre "Structure et propriétés des molécules d'ADN", ces polymères représentent des fils extrèmement long pour un diamètre très faible. Une conséquence est qu'au cours de la purification de l'ADN, ces fils subissent des cassures aléatoires de sorte, qu'en termes de séquences, on obtient un mélange héterogène.

Ce sont des nucléases, c'est à dire les enzymes spécialisées dans la dégradation des acides nucléiques qui ont permis de régler le problème du découpage non aléatoire d'un génome in vitro.

Il existe deux catégories de nucléases selon leur mode d'action : les exonucléases qui dégradent par excision du nucléotide situé en extrémité de chaîne (souvent en 3') et les endonucléases qui coupent des liaisons phosphodiester dans la chaîne.
Parmi les endonucléases, certaines sont non spécifiques et hydrolysent des liaisons phosphodiester au hasard, d'autres présentent une remarquable spécificité de site.
Un ensemble est constitué d'enzymes spécifiques d'ADN bicaténaire, capables de reconnaître une séquence précise (de 4 à 8 nucléotides) et de couper la molécule avec une précision qui atteint le nucléotide.

Exemple de sites de reconnaissance et de coupure pour deux endonucléases de restriction dans une même molécule d'ADN.

Remarque : Ces enzymes sont appelées des endonucléases de restriction car, in vivo, elles permettent aux bactéries de reconnaître certains ADN de bactériophages et de les dégrader, restreignant ainsi leur capacité de croissance, toutes les espèces bactériennes disposent ainsi d'une ou plusieurs de ces armes. Elles se protègent elles mêmes de l'action de ces enzymes en modifiant leur propre ADN aux sites de reconnaissance (également appelés sites de restriction). La modification consiste souvent en une méthylation de certaines bases contenues dans le site de restriction, un ADN exogène, non méthylé, sera reconnu et dégradé.

(I représente le site de coupure pour chaque brin, m un site de méthylation lorsqu'il est connu).

résultat de 4 coupures aléatoires dans une molécule d'ADN circulaire

résultat d'une coupure ciblée dans une même molécule                                                                                                                                                                      

L'examen du tableau précédent montre que tous les sites sont des palindromes (présentent un centre de symétrie), certaines de ces nucléases coupent les deux brins au même niveau (selon l'axe de symétrie) et génèrent des extrémités franches, d'autres d'une façon décalée et génèrent des extrémités débordantes soit en 5' soit (plus rarement) en 3'.

Les extrémités  débordantes sont également appelées extrémités cohésives car, en raison de la structure palindromique des séquences de reconnaissance, elles ont tendance à s'hybrider en solution. Cette situation favorise l'action d'une ligase (une ligase est une enzyme capable de créer une liaison phosphodiester entre deux chaînes polynucléotidiques), elle sera souvent mise à profit dans les recombinaisons in vitro et la construction de molécules chimères.

*Remarque : Dans la plupart des cas, les fragments produits sont phosphorylés en 5' ce qui n'est pas toujours la règle lorsque l'on hydrolyse des polynucléotides.

1.2 CARTOGRAPHIE DES GENES A HAUTE RESOLUTION

Comme on l'a vu dans le premier chapitre, la position de certains gènes sur le chromosome peut être déterminée en mesurant la fréquence de recombinaison entre le gène étudié et un marqueur déjà repéré (autre locus).
Cette cartographie est dépendante d'une densité suffisante de marqueurs. De plus elle ne nous apprend rien sur l'organisation "interne" du cistron : chez un eucaryote supérieur, un gène "moyen" (1000 à 5000 pb) représente 0,01 à 0,001 cM, pour détecter un seul événement de recombinaison à l'intérieur d'un gène, il faudrait pouvoir observer 10 000 à 100 000 individus issus d'un même croisement.

Relier un gène à d'autres, en groupes de liaisons n'est donc que le début de la carte génétique. La cartographie ultime consistera à obtenir la séquence complète des nucléotides du gène et de son voisinage ce qui peut représenter un travail considérable. Entre les deux (position du gène sur le chromosome et séquence) il existe des intermédiaires qui font appel à d'autres techniques que l'évaluation de la recombinaison.

1.2.1 CARTES DE RESTRICTION

Pour disséquer le gène on va utiliser les propriétés des nucléases de restriction qui reconnaissent des points précis du génome au nucléotide près. Chaque enzyme de restriction ayant une cible particulière (voir la première figure), l'identification des sites de coupure permet d'établir une carte extrêmement détaillée appelée carte de restriction.

Les points de coupure sont établis d'après la longueur des fragments obtenus après digestion d'un segment d'ADN par une enzyme de restriction donnée. La taille des fragments est elle même déterminée par électrophorèse. Un jeu de fragments de taille connue sert à calibrer le gel et l'on peut estimer d'une façon relativement précise celle des segments générés par une digestion enzymatique.

La figure ci-contre résume une expérience de cartographie. Dans cet exemple on étudie l'ADN préparé à partir d'un bactériophage fictif dont le génome serait une molécule linéaire de 5000 paires de bases.Une digestion avec l'enzyme Eco R1 permet d'obtenir 4 fragments : 2100, 1400, 1000 et 500 pb , il existe donc 3 sites de coupure (sites de restriction) pour cette enzyme. Une expérience menée en parallèle montre que la molécule de départ (5000 pb) possède deux sites de restriction pour Bam H1 (B) le coupant en 3 morceaux : 2500, 1300 et 1200 pb.
Il existe plusieurs moyens de construire une carte à partir de ces données. Le premier résulte d'une double digestion : on va regarder où sont localisés les sites d'une enzyme dans les fragments obtenus par l'autre. Il serait possible d'extraire chaque bande du gel d'électrophorèse et de soumettre l'ADN à une seconde digestion, pratiquement ce serait très long et fastidieux. Il est plus simple d'ajouter les deux enzymes en même temps dans le milieu d'incubation. Après digestion complète (tous les sites reconnus par l'une ou l'autre enzyme sont coupés), l'électrophorèse permet de séparer des fragments de 1900, 1000, 800, 600, 500 et 200 pb. Le raisonnement repose sur l'additivité parfaite des tailles : si le fragment E 2100 possède un site B à 200 pb de l'extrémité, les fragments générés par la double digestion seront de 200 et 1900 pb.
On remarque que les fragments 1000 et 500 se trouvent à la fois dans la digestion E et dans la double digestion il s'agit donc des extrémités. La suite repose sur le chevauchement des fragments produits par l'une ou l'autre enzyme, si l'on choisit 1000 pb comme premier site de coupure pour E, on doit trouver dans la double digestion un fragment n tel que 1000 + n = taille d'un fragment B qui correspond au 1er site reconnu par B 200 est candidat et l'on place un site B à 1200 pb de l'extrémité ... et ainsi de suite.

Lorsque l'on étudie des régions d'ADN de plus grande taille, les profils d'électrophorèse deviennent plus complexes, des fragments de même taille se rencontrent (on ne pourra pas les distinguer car ils migrent au même endroit) on doit donc adopter d'autres stratégies.

Une approche possible consiste à réaliser des digestions partielles : on régle les conditions de concentration d'enzyme, de température, de temps d'incubation... de telle sorte que statistiquement un site sur deux ou trois soit coupé (au hasard)
On obtiendra par exemple, pour une digestion partielle E, des fragments de 3500, 3100 et 1400 pb, en comparant avec les résultats de la digestion complète, on peut conclure que les fragments 1000 et 2100 sont contigus, de même, 2100 et 1400 sont deux fragments adjacents du 3500 etc...

Le marquage en 5' par du phosphore 32 grâce à la polynucléotide kinase (enzyme capable de phosphoryle des extrémités 5' préalablement déphosphorylées) peut également rendre des services en permettant d'identifier d'emblée le segment terminal. Ici encore on utilise deux enzymes, mais successivement, pour obtenir des fragments dont une seule extrémité est marquée (après électrophorèse, une autoradiographie est nécessaire pour identifier le fragment d'extrémité).
En combinant le marquage 5' et les digestions partielles, on peut lire directement la carte sur l'autoradiogramme puisque tous les segments internes n'apparaissent pas.

1.2.2 UTILISATION DES SITES DE RESTRICTION COMME MARQUEURS

L'analyse mendélienne repose sur l'existence de différentes formes alléliques d'un même "gène" et passe par l'expression de ceux-ci : il s'agit aussi bien de couleurs de fleurs que de la présence d'alloenzymes. La biologie moléculaire a permis de montrer que, quel que soit le niveau de l'observation phénotypique, ce repérage allélique est bien en dessous du polymorphisme réel de l'ADN.
On comprend aisément que les mutations faisant apparaître des formes alléliques nouvelles peuvent modifier la carte de restriction : une insertion ou une délétion affectant la fonction d'un gène vont provoquer une modification de la taille de certains fragments de restriction. Mais la technique va beaucoup plus loin : elle permet de discerner un polymorphisme dans les molécules d'ADN même s'il n'a aucune incidence phénotypique : dans des codons synonymes, dans des introns, dans des séquences répétées, dans des séquences non exprimées ...

Bien que sur le plan évolutif ces variations n'aient probablement pas de grandes significations, elles peuvent être exploitées à plusieurs fins :

• l'identification génétique d'individus et de variétés
• l'établissement de cartes factorielles extrêmement fines en reliant ces marqueurs à des marqueurs phénotypiques et à une cartographie classique.

Le sigle RFLP (restriction fragment length polymorphism) évoque la méthode qui va permettre une analyse allélique directe, au niveau de l'ADN.

Entre deux génomes, des différences de tailles de fragments d'ADN homologues obtenus par digestion à l'aide d'enzymes de restriction seront observées si des substitutions, des insertions ou délétions ont eu lieu au niveau des sites de reconnaissance de l'enzyme ou si des réarrangements de quelque importance se sont produits entre deux de ces sites de restriction. Dans l'exemple ci-contre, on met en évidence une délétion qui racourcit un fragment (B) et une substitution qui supprime un site (C).

Etant donné que l'organisation en fragments caractéristiques se transmet de façon mendélienne, on peut les utiliser pour repérer des loci de la même façon qu'un caractère morphologique avec un certain nombre d'avantages.

• Le nombre d'enzymes de restriction disponibles et la taille d'un génome eucaryote font que le nombre de marqueurs possibles est pratiquement illimité.
• On a accès au génotype sans avoir à passer par son expression : toutes interactions alléliques, épistatiques ou de l'environnement n'interviendront pas.

Exemple de transmission mendélienne des marqueurs "RFLP". De l'ADN de chaque individu figurant dans l'arbre généalogique a été digéré par une nucléase de restriction. Les fragments séparés par elecrophorèse sont hybridés avec une sonde. Quatre allèles (A, B, C, E) sont révélés au locus repéré par la sonde.

Pratiquement : On prépare l'ADN total de différentes espèces, de variétés voire même d'individus. Cet ADN est ensuite incubé en présence de nucléases de restriction et les produits de digestion séparés par électrophorèse. La visualisation de bandes distinctes après électrophorèse ne peut se faire qu'après transfert et hybridation avec une sonde, l'obtention des sondes sera vue au chapitre suivant. En effet, la taille d'un génome eucaryotique est telle que le nombre de fragments générés et leur taille donnent une répartition pseudoaléatoire tout le long du gel.
La figure ci-dessous est un autre exemple d'application à la cartographie : une sonde donnée a été hybridée aux fragments de restriction d'ADN extrait de deux lignées pures de maïs : P1 et P2, d'un individu F1 et de 13 individus de la F2.

On constate :

• qu'une même sonde permet d'étudier plusieurs loci (on observe 3 bandes pour chacun des parents), ce phénomène est assez général en raison de séquences répétées fréquentes chez les eucaryotes.
• que cette analyse permet de détecter directement deux allèles différents à un même locus : A1 et A2 ou B1 et B2 (voir la F1).

La distinction des allèles et des loci se fait en examinant un certain nombre d'individus F2. On voit par exemple que chez le 3, les bandes a1 et b1 sont absentes, elles ne peuvent donc pas représenter les deux formes allèliques d'un même locus (confirmé par a2 et b2 absents en 7). Donc a1 et a2 sont bien deux allèles d'un locus et b1 et b2 sont ceux d'un autre locus.

La technique mendélienne rappelée au premier chapitre permet d'associer ces marqueurs à des éléments cartographiques connus (caractère qualitatif, isoenzyme...) ce qui permet d'établir des cartes précises de plus en plus denses.
Ceci est précieux dans un programme de sélection : si un caractère important (appelé Q dans la figure) est associé au marqueur A1 par exemple, on repère très facilement en F2 les allèles A1 et de prédire que le caractère Q sera présent.

         

Conclusion : L'analyse directe du polymorphisme de l'ADN se répand très rapidement pour des raisons évidentes : il est possible d'étudier des variations et de les corréler à de futurs phénotypes de façon très précoce (et non destructive). Ces applications vont aller des programmes de sélection variétale jusqu'aux diagnostics anténataux. il est possible d'aborder les caractères quantitatifs par l'analyse mendélienne classique.

* Remarque : repérage des caractères quantitatifs
Les cartes génétiques classiques ne recensent que des caractères qualitatifs c'est à dire des allèles dont la forme mutée se distingue clairement sur le plan phénotypique.
Des caractères tels que la taille, le poids, la résistance à des agents pathogènes... sont gouvernés par un nombre important de gènes, chacun d'eux participe d'une façon minime à l'élaboration du phénotype. La mutation de l'un d'entre eux a le plus souvent un effet imperceptible qui exclut les observations classiques de recombinaison. De plus, leur expression est particulièrement sensible aux fluctuations de l'environnement. L'association étroite de marqueurs "RFLP" à des loci gouvernant de tels caractères permet de les traiter par l'analyse mendélienne.

1.2.3 SEQUENCAGE DES GENES

L'étape ultime de la cartographie est la séquence, non pas du génome mais modestement de petits morceaux intéressants délimités par la cartographie de restriction.

Le principe du séquençage est simple, la réalisation plus ou moins délicate selon les méthodes utilisées.

Il s'agit, en partant du segment à étudier, de générer des fragments qui tous ont la même origine et qui tous se terminent par un nucléotide de même nature : il faut construire 4 séries de fragments : tous commencent au même point, une série se termine par A, une autre par T, une autre par G et une dernière par C.

Exemple pratique: On suppose le segment à étudier cloné dans un vecteur simple brin (bactériophage M13, cf plus loin). Connaissant bien le vecteur, on dispose de petites séquences complémentaires de régions proches de l'insertion.
Après hybridation, ces séquences peuvent servir d'amorce à une ADN polymérase. L'astuce consiste à réaliser une synthèse in vitro en ajoutant aux nucléotides (dNTP) nécessaires à la réaction une petite quantité de didéoxynucléotides. Si l'un d'entre eux est incorporé, la chaîne ne présente plus d'extrémité 3' OH et la polymérase s'arrête. On prépare 4 réactions avec respectivement une petite quantité de ddATP, ddTTP, ddGTP et ddCTP. Statistiquement, la réaction s'arrêtera respectivement en face de n'importe quel T, A, C et G selon le tube. Les produits de la réaction, dans chaque tube, seront des fragments qui tous commencent à l'extrémité 3' de l'amorce et qui tous se terminent à chaque A possible, T, G ou C. Après séparation de ces fragments par électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant, les quatre pistes révèlent directement la séquence.

D'autres méthodes, utilisant des réactions chimiques spécifiques de bases pour obtenir les familles de fragments sont également utilisées.

1.2.4 PCR : REACTION DE POLYMERISATION EN CHAINE

Lorsque l'on possède des informations (même partielles) sur la séquence d'un fragment d'ADN, on peut utiliser les propriétés de l'ADN polymérase, in vitro, pour amplifier à l'infini ce fragment, sans faire appel à un clonage in vivo.
Ces dernières années, l'utilisation de la réaction de polymérisation en chaîne ou PCR (polymerase chain reaction) a révolutionné les stratégies de la génétique moléculaire et trouvé de très nombreuses applications.
Le principe est illustré dans la figure suivante.
A partir de la séquence de fragments d'ADN, on va construire deux amorces capables de s'hybrider dans la région 3' de chaque brin de l'ADN à amplifier. Chaque amorce sera ensuite allongée par une ADN polymérase. Cette étape conduit à deux copies de la séquence initiale. Ces deux copies sont ensuite dénaturées et les mêmes amorces sont utilisées pour initier un nouveau cycle d'élongation conduisant à quatre copies, la répétition des cycles "dénaturation, hybridation des amorces, élongation" permet une amplification exponentielle de la séquence d'ADN située entre les deux amorces.

                                                      PREMIER CYCLE 
                                                    molécule native, double brin

                                                    dénaturation et hybridation des amorces

                                                    élongation des amorces par l'ADN                                                                                           polymérase

                                                    DEUXIEME CYCLE

                                                    dénaturation, hybridations des amorces                                                                            

                                                                            etc...

Pratiquement, un thermocycleur permet de réaliser cette amplification sans intervention, pour cela, on ajoute un excès d'amorces au milieu réactionnel contenant l'ADN à amplifier et l'on utilise une ADN polymérase thermostable (extraite d'une bactérie se développant dans des sources chaudes : Thermus aquaticus) résistante aux températures de dénaturation.
En fin d'expérience, la quantité d'ADN est telle qu'après électrophorèse une simple coloration permet de visualiser la bande correspondant au produit d'amplification.
A partir d'une très faible quantité d'ADN génomique au départ (5 nanogrammes par exemple) il est possible d'obtenir un milliard de copies d'un exemplaire unique de séquence, aucune digestion enzymatique préalable n'est nécessaire.
On comprend que la PCR soit rapidement devenue la méthode de base pour tout problème de détection de séquence (empreintes génétiques, repérage d'OGM ...).
Ce ne sont pas les seuls avantages de cette technique, les mêmes amorces peuvent, par exemple, être utilisées pour de l'ADN de différents individus, de différentes variétés ou races et révéler des variations alléliques sans clonage biologique; elle rend de précieux services dans le domaine du typage génétique de la phylogénie ...).

relire ?

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Document modifié le 7 janvier, 2008