DISSECTION ULTIME DES GENES ET RECOMBINAISON IN VITRO

2 TECHNOLOGIES DE L'ADN RECOMBINANT

Les techniques d'étude de l'ADN sont devenues si performantes qu'il est actuellement courant d'isoler le segment d'ADN correspondant à n'importe quel gène spécifique.
La clé de voûte de ces technologies réside dans la possibilité d'amplification de toute séquence définie. Cette amplification, le plus souvent par clonage du fragment d'ADN (un clone étant défini comme une population de cellules ou de molécules identiques à l'originale), permet d'obtenir des quantités illimitées de molécules d'ADN de séquence homogène.

2.1 CLONAGE DES GENES

Un schéma ultra simplifié d'une expérience typique de clonage nécessite les éléments suivants :

• l'ADN intéressant (à étudier ou pour ce qu'il apporte) appelé également ADN passager, ADN étranger ou ADN cible)
• un vecteur de clonage (ou véhicule), dans l'exemple il s'agit d'un plasmide c'est à dire un élément génétique bactérien, extrachromosomique, capable de réplication autonome.
• une nucléase de restriction
• une ligase
• une cellule (procaryote ou eucaryote) pouvant servir d'hôte biologique.

De nombreuses enzymes de restrictions génèrent des extrémités cohésives et l'on peut insérer des fragments d'ADN digérés dans un vecteur présentant les mêmes extrémités c'est à dire traité par la même enzyme. Les nouvelles molécules sont ensuite refermées par une ligase. Cette recombinaison in vitro conduit à une molécule "chimère" qui sera transférée dans un hôte approprié par des moyens qui dépendent du choix de la cellule hôte. Après un temps de culture convenable on pourra obtenir des clones contenant chacun un vecteur recombiné, les clones différent entre eux par la nature de la séquence insérée dans le vecteur.

Comme le montre la figure ci-contre, après l'étape de transformation génétique de l'hote, la population se compose en fait d'une grande quantité de cellules non transformées et parmi les bactéries transformées, beaucoup le sont par un vecteur recircularisé. Il faut donc pouvoir isoler rapidemant les clones recombinés et caractériser les molécules recombinées, c'est cette partie du travail, la plus délicate, qui a apporté énormément de renseignements sur la structure des gènes.
Le procédé de clonage lui même n'est qu'un moyen pour identifier et isoler des gènes rapidement.

2.2 LES VECTEURS DE CLONAGE

Comme on le voit, le vecteur joue un rôle essentiel dans toute expérience de clonage. On va donc étudier les véhicules avant de parler des passagers.
La plupart des fragments d'ADN étant incapable de réplication autonome, les vecteurs sont dérivés de réplicons naturels tels que les phages et les plasmides.
Les plasmides sont des petites molécules circulaires d'ADN double brin, ils portent certains gènes fonctionnels (tels que des gènes de résistance à certains antibiotiques) et on les appelle parfois "les pièces de rechange génétiques" des bactéries.
Les plasmides naturels ne sont pas utilisés tels quels car un vecteur doit répondre à un certain cahier des charges :

• être aussi petit que possible car, dès que l'on dépasse 15kb, l'efficacité de transformation de la cellule hôte diminue rapidement.
• être bien cartographié (gènes et sites de restriction) l'idéal étant de connaître la séquence complète.
• il doit se répliquer facilement dans la cellule hôte afin que de grandes quantités de molécules recombinées puissent être préparées.
• il doit posséder un marqueur de sélection qui permette de distinguer les cellules transformées par le vecteur des cellules non transformées
• un vecteur idéal devrait de plus posséder un marqueur qui permette de distinguer les clones transformés par un vecteur recombiné de ceux transformés par ce vecteur non recombiné.
• il doit posséder le plus possible de sites de restriction différents (mais chacun en un seul exemplaire) pour permettre une grande souplesse dans le clonage de différents produits de restriction.

L'une des plus célèbres constructions est celle du plasmide pBR 322 (Bolivar et Rodriguez), de très nombreux vecteurs utilisés actuellement en sont dérivés.

Le succès de ce vecteur tient à deux points :

• il s'agit d'un plasmide dont la réplication est sous contrôle "relâché" contrairement à beaucoup d'autres qui sont sous contrôle "stringent" c'est à dire que leur réplication est dépendante de la synthèse protéique et de l'ADN polymérase III, on en trouve généralement de 1 à 5 par cellule, les plasmides sous contrçole "relaché" utilisent la polymérase I et peuvent se répliquer en absence de synthèse protéique, on en trouve de 30 à 50 copies par cellule ce qui augmente l'amplification.
• deux gènes de résistance, l'un à l'ampicilline, l'autre à la tétracycline peuvent servir de marqueurs pour sélectionner aisément les clones transformés par des plasmides recombinés.

La figure ci-contre schématise ce vecteur de 4363 paires de bases qui contient des sites de restriction en un seul exemplaire (sites de restriction uniques pour plusieurs nucléases) dont certains sont situés dans les gènes de résistance.

L'insertion de la séquence à cloner dans l'un ou l'autre de ces gènes de résistance (au site BamHI dans le gène de résistance à la tetracycline, dans l'exemple ci dessous) l'inactive, ce qui offre un moyen très pratique d'identification des clones transformés par des vecteurs recombinés selon le génotype :

clone	génotype
non transformé	ampS,tetS
transformé par un vecteur recircularisé	ampR,tetR
transformé par un vecteur recombiné	ampR,tetS      (*)

                                     (*) dans l'exemple ci-dessus

D'autres vecteurs dérivés de celui-ci présentent des améliorations portant essentiellement sur la facilité de criblage des clones recombinés, sur la facilité d'insertion de l'ADN étranger, sur l'adaptation à l'utilisation ultérieure de l'ADN cloné (cartographie, séquençage, expression, étude de la régulation de l'expression...) et sur la taille des segments insérés.

• Le bactériophage M13 par exemple a été modifié pour en faire un vecteur, il présente la particularité de posséder un génome à ADN simple brin ce qui sera intéressant pour le séquençage par exemple, après infection, un brin complémentaire est synthétisé, il se comporte donc comme un plasmide à l'intérieur de la bactérie et pourra être manipulé comme tel.
  * Remarque : N'oublions pas que les recombinaisons in vitro utilisent les propriétés des nucléases de restriction, le substrat est donc de l'ADN bicaténaire.
• Le bactériophage lambda possède une grande région de son génome non essentielle à sa reproduction, elle pourra être éliminée et remplacée par un ADN passager de l'ordre de kilopaires de bases alors qu'un plasmide n'en tolère qu'une quinzaine.
• Les cosmides combinent les avantages de clonage des plasmides et augmentent la taille d'insertion possible dans les phages lambda jusqu'à, une quarantaine de kilo paires de bases.
• Les BAC ou chromosomes bactériens artificiels (Bacterial Artificial Chromosomes) sont dérivés du facteur F de conjugaison (voir le chapitre "Régulation de l'expression des gènes"). Ils possèdent donc une origine de réplication et peuvent, naturellement, intégrer des fragments d'ADN bactérien allant jusqu'à 300kpb. Utilisés comme vecteurs, ils permettent de cloner des fragments de 100-150 kpb et présentent tous les avantages des vecteurs plasmidiques.
• Les YAC ou chromosomes de levure artificiels (Yeast Artificial Chromosomes) sont complétement differents des prézcédents car dérivés d'éléments eucaryotiques et seront hébergés et reproduits par des cellules de levure. La construction repose sur des séquences centromériques et télomériques et une origine de réplication de levure. Un site de clonage permet d'inserer des fragments d'ADN étranger allant jusqu'à 2Mpb. Ces éléments sont dupliqués et ségrègent à la mitose comme des chromosomes. Ils représentent les seuls vecteurs capables de réaliser des ensembles de clones chevauchant pouvant couvrir l'ensemble d'un génome Eucaryote complexe.

Il faut donc choisir le vecteur en fonction des cribles dont on disposera pour repérer le clone intéressant et en fonction de la nature de l'ADN cloné c'est à dire du "passager".

2.3 CONSTRUCTION DE "BANQUES DE GENES"

Le vecteur étant choisi, la première étape est celle de la préparation de l'ADN à insérer. On va distinguer deux procédures, l'une conduisant à la réalisation de banques génomiques l'autre à des banques d'ADN complémentaire.

2.3.1 CAS DE LA CONSTRUCTION D'UNE BANQUE GENOMIQUE

L'ADN est préparé à partir du tissu le mieux adapté, puis découpé d'une façon la plus aléatoire possible (par cassures mécaniques ou par digestion incomplète par une nucléase de restriction). La construction d'une banque génomique implique le clonage de la totalité du génome, le seul moyen d'y parvenir est de partir de fragments chevauchants.
Tous les fragments de taille admissible par le vecteur choisi auront la possibilité d'être clonés, tout le génome pourra être représenté. Le nombre minimum de clones nécessaires pour qu'une séquence quelconque, appartenant à un génome de taille donnée soit présent dans la banque (qui, théoriquement, contient l'ensemble des séquences d'ADN de l'espèce considérée) peut se calculer par :

ln(1-P) N = ---------------                  L-X          ln 1- ------                   M

N : nombre de clones constituant la banque (ou bibliothèque)
P : probabilité pour qu'une séquence donnée soit présente dans la banque (une valeur de 0,99 est acceptable) L : taille moyenne des fragments insérés
X : taille de la séquence souhaitée
M : taille du génome

   Quelle que soit la prétention de cette formule, ceci veut dire qu'une banque génomique réalisée dans un vecteur dérivé du phage lambda devra comprendre environ  40 000 clones différents pour un génome de drosophile et 800 000 pour celui du maïs ou de l'homme. Ces banques sont donc très lourdes et dans bien des cas on constitue un autre type de banque.

2.3.2 CAS DE LA CONSTRUCTION D'UNE BANQUE D'ADN COMPLEMENTAIRES

Elles reposent sur une découverte qui a bouleversé le dogme central de la biologie moléculaire : pour certains virus dont le matériel génétique est de l'ARN, il existe un flux d'information de l'ARN vers l'ADN. Cette étape obligatoire pour leur reproduction est assurée par une enzyme particulière : la transcriptase réverse. Elle permet une synthèse d'ADN double brin (c'est donc une ADN polymérase) à partir d'une molécule d'ARN. Elle représente également un outil très utilisé en génétique moléculaire. On peut en effet synthétiser in vitro des molécules d'ADN dont l'un des brins a une séquence parfaitement complémentaire de celle d'un ARN donné, appelé ADNc .

NB: in vitro, l'activité ribonucléasique de la transcriptase réverse est difficile à maîtriser et l'on utilise souvent d'autres stratégies enzymatiques pour synthétiser le deuxième brin d'ADN.

Les banques dites d'ADN complémentaire présentent les avantages suivants :

• sachant que dans toute cellule, une très faible partie du génome est transcrit en ARN, quel que soit la catégorie cellulaire qui va servir de point de départ, la banque nécessitera beaucoup moins de clones et l'enrichissement en clones recherchés pourra être considérable si l'on choisitbien un organe, son stade de développement...
• on ne collectionne que des séquences codantes (sans introns) qui pourront s'exprimer dans un hôte procaryote même si elles sont d'origine eucaryote.
• elles sont obligatoires pour cloner les gènes des virus à ARN (la majorité des virus des végétaux).

2.4 PREPARATION DES VECTEURS RECOMBINES

Dans les deux cas : découpage mécanique d'ADN génomique ou synthèse d'ADN complémentaire, l'étape suivante est l'insertion dans un vecteur.

L'utilisation de nucléases de restriction produisant des extrémités cohésives simplifie cette étape mais le découpage mécanique et la synthèse d'ADNc ne procurent pas de molécules à extrémités cohésives.

Pour palier cet inconvénient, une technique encore largement utilisée consiste à greffer des "queues" homopolymériques sur le vecteur et leurs complémentaires sur les fragments d'ADN. On utilise un site Pst I du vecteur car elle laisse des extrémités 3' débordantes, ces extrémités vont être allongées par un oligo dG grâce à la transférase terminale (enzyme qui polymérise, de façon non spécifique, des nucléotides à une extrémité 3' libre, elle n'utilise pas de modèle comme l'ADN polymérase). De la même manière, on greffe une queue oligo dC aux extrémités 3' de l'ADN à insérer.
Après hybridation et ligation partielle, les cellules hôtes sont transformées, elles opèrent elles-mêmes une réparation et la ligation recréant du même coup deux sites Pst I qui pourront être utilisés, après amplification, pour récupérer l'ADN cible à partir des clones transformés.

Une autre méthode consiste à greffer, à l'aide d'une ligase, des oligonucléotides (4 ou 6 paires de nucléotides) représentant des sites de reconnaissance pour une nucléase de restriction aux extrémités franches des fragments d'ADN à cloner. Après ligation de ces petites molécules adaptatrices, la digestion par l'enzyme appropriée va créer des extrémités cohésives. On aura la précaution d'avoir protégé au préalable d'éventuels sites internes de reconnaissance (par méthylation par exemple).

2.5 EXPLOITATION DES BANQUES

Plusieurs techniques éprouvées permettent de construire des banques. Il reste à les exploiter, même avec une banque d'ADNc, le nombre de clones est important et le tri représente la partie la plus délicate des expériences de clonage, il existe de nombreuses stratégies mais aucune n'est universelle.

* Remarque : les termes de cribler et de sélectionner n'ont pas la même signification: lors de la sélection, on élimine tous les clones non intéressants, le criblage permet de repérer le clone intéressant.

Le tri peut se faire par sélection lorsque le gène intéressant confère un phénotype particulier à l'hôte tel qu'une résistance à un antibiotique particulier auxquel les cellules sauvages sont sensibles : la culture sur un milieu contenant cet antibiotique ne fera apparaître que les clones transformés contenant ce gène précis.

Le tri par criblage reste le plus courant.

La détection immunologique du produit du gène représente un crible intéressant si le gène recherché est exprimé dans la cellule transgénique ce qui n'est pas toujours le cas.

Le criblage par hybridation de l'ADN des clones transformés avec une sonde spécifique constitue une méthode de choix. L'hybridation peut se faire in situ : on effectue des répliques de clones bactériens cultivés en boîte de Pétri sur des disques de nitrocellulose, après un temps de culture suffisant, les bactéries de ces répliques sont ensuite lysées par la soude qui, en même temps, dénature l'ADN, les molécules simple brin correspondantes se trouvent immobilisées à l'emplacement de chaque clone. Après hybridation, avec la sonde radioactive, l'autoradiographie révélera les clones positifs.

Le problème est déplacé vers celui de l'obtention de la sonde spécifique, correspondant au gène recherché.

• s'il s'agit d'un gène peu évolué, on peut utiliser une sonde "hétérologue" (en fait une séquence homologue mais provenant d'un autre organisme) en comptant sur une homologie de séquence suffisante pour s'hybrider dans des conditions qui ne donnent pas de faux positifs.
• lorsqu'une lignée cellulaire synthétise, à un moment donné du développement, un messager majoritaire, on peut tenter sa purification et réaliser un ADN complémentaire qui, une fois cloné servira de sonde pour une banque génomique.
• si l'on connaît très bien le produit du gène, c'est à dire la séquence, même partielle, en acides aminés, on pourra construire des oligonucléotides selon les codes possibles et "partir à la pèche" avec ces sondes artificielles.
  
• Dans les cas désespérés, c'est à dire lorce que l'on ne possède pas de sonde et que l'on n'a aucune idée du produit du gène, connu uniquement par la manifestation phénotypique d'un allèle muté, il reste d'autres solutions, par exemple, la "marche sur chromosome" (chromosome walking) : Par des méthodes faisant appel à des croisement traditionnels et à l'analyse mendélienne, on va essayer d'associer des marqueurs RFLP au locus considéré. L'idèal étant d'encadrer le locus par des marqueurs distants de moins d'un centiMorgan. Le premier marqueur constitue une sonde pour identifier un clone (parmi une banque génomique) qui servira de départ. La cartographie de restriction nous permettra d'identifier un segment situé à une extrémité qui sera, à son tour utilisé comme sonde pour cribler un clone chevauchant et ainsi de suite jusqu'à un second marqueur connu. La séquence recherchée se trouve obligatoirement parmi les clones identifiés. Si l'un d'entre eux peut complémenter un mutant (par transgénie restituant le phénotype sauvage par exemple), c'est qu'il s'agit de la séquence recherchée.

                                                                                       

Le clonage biologique à l'aide d'un vecteur approprié est applicable à n'importe quelle séquence d'ADN (naturelle ou synthétique) et représente un outil d'amplification de molécules homogènes très puissant mais il ne s'agit que d'un outil. Les technologies de l'ADN recombiné in vitro sont à la base de la génétique moderne.

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Document modifié le 12 décembre, 2006