Replication in vitro
L'expérience décrite ci dessus prouve qu'une synthèse de polydésoxyribonucléotide est réalisable in vitro mais ne prouve pas que l'ADN synthétisé est conforme au modèle ni que la synthèse soit une réplication semi-conservative.
La suite du travail va consister à tenter la synthèse in vitro d'un ADN "biologiquement actif", l'activité biologique la plus facile à détecter étant, à l'époque, la capacité d'infection d'un ADN de bactériophage.
Le modèle choisi est le phage phi-X-174 soit une molécule circulaire d'environ 5000 nucléotides seulement. Nucléotides et non pas paires de nucléotides car il s'agit, pour la particule phagique d'un ADN simple brin que nous appellerons le brin +. Le changement d'un seul de ces nucléotides rend la molécule inactive (non infectieuse). La réalisation d'une copie infectieuse in vitro va préfigurer la technologie de l'ADN recombinant.

• In vivo, la première étape de l'infection par ce bactériophage simple brin est la synthèse d'un brin complémentaire pour réaliser une forme circulaire double brin à partir de laquelle seront reproduits des brins + qui assureront la descendance phagique.
• Un premier problème se posa pour la synthèse in vitro d'un brin - : l'ADN polymérase purifiée ne peut qu'attacher l'extrémité 5' d'un nucléotide à l'extrémité 3' d'une chaîne en cours de synthèse, elle ne peut relier des polynucléotides et donc ne peut pas réaliser la liaison phosphodiester qui permet de circulariser un brin d'ADN. Le problème a été résolu par la purification d'une enzyme qui, in vivo, remplit cette fonction : l'ADN ligase dont nous aurons souvent l'occasion de parler.
  Le système va donc comprendre :
  • des molécules d'ADN purifiées de phi-X-174 (brin +)
  • les 4 désoxyribonucléotides
  • l'ADN polymérase
  • la ligase en principe, il doit assurer la synthèse de brins - complémentaires du brin plus et circulaires.
• Deuxième problème : comment séparer les brins - des brins + ?
  Ce deuxième problème a été surmonté par l'utilisation d'un précurseur particulier à la synthèse d'ADN : la 5-bromodésoxy uridine, cet analogue de nucléotide est utilisé par la cellule comme de la thymidine (sera apparié à l'adénine) mais le brome va "alourdir" la molécule d'ADN qui utilise ce précurseur. La différence de densitéest suffisante pour permettre la séparation de brins + (comportant de la thymidine) de brins - (comportant de la bromodésoxyuridine) par ultracentrifugation sur un gradient de densité de CsCl.
• Troisième problème : le brin - synthétisé in vitro n'est pas infectieux, seul un brin + peut l'être. Il va donc falloir recommencer une synthèse in vitro en utilisant les brins - comme modèles.

Cette stratégie a permis de synthétiser des molécules qui vont s'avérer infectieuses : aucune erreur sur 5000 nucléotides assemblés in vitro !