Cette technique décrite en 1985 (K. MULLIS et collaborateurs)
permet d'amplifier des séquences d'ADN de manière spécifique et
d'augmenter de manière considérable la quantité d'ADN dont on
dispose initialement. Elle nécessite de connaître la séquence
des régions qui délimitent l'ADN à amplifier. Ces séquences serviront
à synthétiser des amorces oligonucléotidiques complémentaires
(de longueur de 18 à 30 nucléotides en général). Ces oligonucléotides
serviront à délimiter la portion d'ADN à amplifier. L'ADN polymérase
les utilisera comme amorces.
Réalisation pratique
La technique comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend
une succession de trois phases :
- Une phase de dénaturation par la chaleur pour séparer les deux
brins d'ADN (92-95°C)(30 secondes-1 minute).
- Une phase d'hybridation avec les deux amorces spécifiques entre
50-60°C. Cette température dite d'annealing (ou accrochage
des amorces) est un paramètre important pour la réussite
de la PCR et doit être calculée en fonction du Tm
(Température de fusion ou Melting température) des
deux amorces.
La première amorce se fixe sur un brin d'ADN, l'autre sur le
brin complémentaire (30 secondes-1 minute).
- Une phase d'extension par l'ADN polymérase à partir des amorces
à 70-72°C (1-2 minutes). La durée de cette phase dépend
de la taille du fragment à amplifier.
Cette technique a pris un essor considérable avec l'introduction
d'une ADN polymérase résistante à la chaleur. Cette ADN polymérase
ou Taq polymérase est extraite d'une bactérie thermophile (Thermus
aquaticus). Elle permet une automatisation des différents
cycles (dans des appareils appelés thermocycleurs). Le nombre
de cycles est généralement compris entre 25 et 40. Cette méthode
permet d'amplifier l'ADN compris entre les deux amorces d'un facteur
de 105 à 106. Les conditions doivent être optimisées
en fonction d'un certain nombre de paramètres: concentration en
MgCl2, concentration en amorces,
spécificité des amorces, quantité d'ADN matrice etc...
Le choix des amorces est particulièrement crucial pour obtenir
des résultats satisfaisants (spécificité, taille, paramètres physico-chimiques.....).
L'introduction de logiciels spécialisés et des bases de données
nucléotidiques a permis de réaliser des choix plus rationnels.
La Taq polymérase extraite de Thermus aquaticus présente
une activité exonucléasique 5' 3', mais elle est dénuée d'activité
exonucléasique 3' 5', c'est-à-dire de la fonction d'édition. Elle
peut insérer des bases qui ne suivent pas la règle classique d'appariement
et ceci au hasard. On estime qu'elle réalise une mauvaise incorporation
toutes les 104 à 105
bases.
Cette technique a évolué considérablement. De nouveaux types de
PCR ont été introduits. Nous citerons brièvement :
- La PCR dite " Multiplex " pour amplifier des gènes avec de nombreux
exons (le gène CFTR impliqué dans la mucoviscidose possède 27
exons) ou plusieurs gènes différents simultanément.
Il est en effet possible d'introduire dans le milieu d'amplification
des couples d'amorces spécifiques différentes et ce sans compétition
entre ces amorces.
- La PCR dite " Nested PCR ". Elle fait intervenir une seconde
PCR réalisée en utilisant des nouvelles amorces situées à l'intérieur
du domaine défini par les amorces de la première PCR et a pour
objectif d'améliorer la spécificité.
- La PCR quantitative. Dans ce type de PCR, on cherche à estimer
le nombre de copies présent dans la séquence cible d'ADN ou d'ARN.
La proportionnalité entre le nombre d'amplifications et le nombre
de copies n'est valable que pour un nombre de cycles PCR faible.
