Utilisations des produits PCR
 
Les utilisations des produits PCR sont très variées, nous citerons quelques exemples (cette liste n'est pas exhaustive) :

• Mise en évidence de mutations ponctuelles par hybridation des produits PCR avec des sondes oligo-nucléotidiques (technique dite du "dot-blot").
  Les produits PCR peuvent après transformation en monobrins être hybridés avec des sondes oligonucléotidiques fixées sur un support solide. Ces sondes correspondent à des séquences normales et pathologiques (présence de mutations ponctuelles par exemple) pour un gène donné.
   
• Analyse de restriction.
  Le produit PCR est soumis à une digestion enzymatique par une enzyme de restriction. Si une mutation ponctuelle modifie le site de restriction initialement présent, la taille des fragments d'ADN obtenus après digestion sera modifiée et décelable après électrophorèse des fragments d'ADN (sur gel d'agarose ou gel de polyacrylamide).
  A titre d'exemple, la mutation ponctuelle (GAGàGTG) sur le sixième codon du premier exon du gène b de la globine humaine entraîne l'apparition d'une hémoglobine anormale appelée hémoglobine S (mutation ponctuelle d'un acide aminé: GluàVal). Cette anomalie est répandue dans le monde entier. Elle est responsable à l'état homozygote d'une pathologie grave: la drépanocytose homozygote.
  Cette mutation entraîne une modification du site de restriction de l'enzyme Dde I: C / TNAG (N = A, T, C ou G). La mutation Hb S conduit à une mutation ponctuelle au niveau du codon 6 avec disparition du site de restriction pour l'enzyme Dde I.
  L'électrophorèse des produits PCR après digestion par l'enzyme Dde I permet d'affirmer ou d'infirmer la présence d'une mutation GAGàGTG sur le codon 6 par la comparaison des tailles des fragments. On peut donc confirmer l'état hétérozygote ou l'état homozygote pour cette mutation.
   
• Introduction du produit PCR dans un vecteur: clonage du produit PCR.
   
• Séquençage direct du produit PCR (voir cours sur le séquençage).
   
• Analyse électrophorétique des produits PCR: technique DGGE et technique SSCP.
  

Ces techniques d'analyse électrophorétiques des produits PCR sont particulièrement utiles pour mettre en évidence des mutations ponctuelles au niveau d'un gène. Des produits PCR (ou amplimères) particuliers sont formés si des mutations sont présentes sur l'ADN initial. Les produits PCR seront différents en fonction de la présence d'une séquence normale, d'une séquence mutée (homozygote, hétérozygote ou composite)(voir schémas).

Technique DGGE (pour "denaturating gel gradient electrophoresis").
La température de fusion d'un produit PCR (ADN double brin), c'est-à-dire la température moyenne de séparation des deux brins est fonction de sa séquence. Une mutation ponctuelle qui change donc la séquence entraîne une modification de la température de fusion. Cette modification est mise en évidence par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence d'un gradient d'agent dénaturant.

Technique SSCP (pour "single strand chain polymorphism".
La technique SSCP est basée sur l'analyse électrophorétique des produits PCR sous forme de fragments simple brin. On amplifie par PCR une région que l'on désire étudier et on compare la mobilité de l'ADN dénaturé portant une mutation par rapport à celle d'un fragment de référence comportant une séquence normale. Une mutation ponctuelle au sein d'une séquence modifie suffisamment la structure secondaire de l'ADN monobrin pour qu'il en résulte des changements de migration électrophorétique sur gel de polyacrylamide.
Les techniques DGGE et SSCP sont concurrencées par des techniques de chromatographie liquide à haute performance avec des températures d'élution variables (DHPLC: "denaturing high pressure liquid chromatography").