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  Les phages (2/2)

Un exemple de vecteur de cette catégorie est le phage lambda-GEM®-11 proposé par la société de biotechnologie Promega. Ce phage accepte des fragments d'ADN de 9 kb à 23 kb.
Il possède des promoteurs pour la T7 ARN polymérase et la SP6 ARN polymérase. Ces promoteurs d'ARN polymérases permettent la synthèse de sondes ARN à partir d'une extrémité du fragment cloné.

La T7 ARN polymérase est extraite des colibacilles (E. coli) infectés par le phage T7. La SP6 ARN polymérase est extraite d'une souche de Salmonella typhimurium.
Sur le bras gauche (20 kb), on retrouve successivement dans le sens 5'à 3', un site pour l'enzyme Sfi I, puis le promoteur T7, suivi par des sites de restriction uniques (Sac I, Xho I, Bam HI, Avr II, Eco RI et Xba I).
Sur le bras droit (9 kb), on retrouve dans le sens 5'à 3', des sites de restriction uniques pour Xba I, Eco RI, Avr II, Bam HI, Xho I et Sac I, suivis par le promoteur SP6 et enfin un site Sfi I.
Il est important de noter l'orientation des promoteurs des ARN polymérases T7 et SP6 pour la synthèse des ARN messagers correspondants.

Notes complémentaires pour comprendre le fonctionnement des ARN polymérases :
Les ARN polymérases copient l'ADN double brin en ARN et possèdent les propriétés suivantes :
  • Elles n'ont pas besoin d'amorce pour commencer la synthèse de l'ARN.
  • Elles ont, bien entendu, besoin des quatre nucléosides triphosphates (NTPs; N = A, G, U et C) et de Mg2+.
  • Elles n'ont pas de fonction d'édition.
  • Elles doivent impérativement reconnaître un promoteur spécifique.
  • Comme toutes les polymérases, elles synthétisent le nouveau brin dans le sens 5'à 3'.
Avantages et désavantages des phages
Avantages :
La taille des fragments d'ADN insérables est supérieure à celle des plasmides (40-50 kb).
La transformation des bactéries (= incorporation des phages) est plus efficace que pour les plasmides.
Désavantages :
Nombre de sites de restriction restreints dans le génome des phages.
Obligation d'empaqueter l'ADN.
Contraintes de taille pour l'ADN à insérer.
   

© Université de Tours - 7 janvier, 2008