0/Le système de sélection sur ampicilline : la présence du gène de résistance à l’ampicilline dans PGEM-T permet aux bactéries ayant intégrées la plasmide de pouvoir croître sur un milieu contenant de l’ampicilline ce dont elles sont incapables normalement.
Colonies sans plasmide : pas de croissance sur milieu + ampicilline
Colonies avec plasmide : croissance sur milieu + ampicilline.

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1/Le système B_gal
Le gène lacZ d'E. coli codant pour la ß-galactosidase est le gène rapporteur type. La ß-galactosidase catalyse l'hydrolyse du X–Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-ß-D-galactopyranoside) conduisant à la production d'un précipité bleu facilement visualisable au microscope. Notre vecteur PGEM-T est ouvert au milieu du gène lacZ. Lors de l'étape de ligation, le vecteur est refermé. Deux situations se présentent ensuite:

- pas d'insert dans le vecteur fermé: le gène lacZ est actif: la B-gal est active et hydrolyse le X-gal avec formation d’un précipité bleu. Les colonies sont bleues.

- présence de l'insert dans le vecteur fermé: le gène lacZ est inactif (la protéine n'est plus synthétisée). Les colonies sont blanches.

On a donc un double système de sélection qui permet à la fois de contrôler la présence ou non du vecteur dans les colonies et la présence ou non de l’insert dans ce vecteur.

3. Interprétation des résultats

3.1 Vérification des contrôles

- Contrôle de non contamination (tube 1):

- Contrôle du vecteur (tube 2)

- Contrôle de l'efficacité de transformation (compétence des bactéries) (tube 4)

On doit obtenir entre 10⁶ et 10⁸ bactéries transformées / µg ADN plasmidique pour considérer que nos bactéries sont compétentes. Si pas de bactéries sur milieu + ampicilline cela veut dire que le vecteur porteur du gène de résistance à l’ampicilline n’est pas intégré dans le génome des bactéries et que la transformation a échouée.
Dans notre exemple (tube 4), on obtient 10⁶ bactéries bleues pour 0.05 µg de plasmide au départ soit 2.10⁷ bactéries / µg ADN plasmidique. On peut donc considérer que notre protocole de transformation est correct et que le taux de compétence des bactéries est suffisant.

3.2 Transformation (tube 3)

si pas de colonies blanches qui poussent sur milieu + X-gal : pas d’insert : on a pas cloné notre fragment.

Conclusion : le gène d’intérêt ainsi cloné pourra ensuite être sous cloné à l’infini dans différents vecteurs de destination et pour différents usages (expression, production).

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Document modifié le 7 janvier, 2008