Méthode de Sanger

• Pour connaître la séquence des ADN, on fait synthétiser un brin d'ADN par une enzyme spécifique.
• L'enzyme commence son travail à partir de l'extrémité 3' d'une sonde hybridée qui sert d'amorce. Elle ajoute des nucléotides complémentaires de ceux du brin d'ADN qu'elle copie.
• On lui donne pour substrats des désoxynucléotides triphosphates normaux mélangés avec des didésoxynucléotides dont la fonction alcool secondaire en 3' est réduite ce qui empêche la synthèse de se poursuivre au delà.
• Les didésoxynucléotides incorporés en dernier sont marqués spécifiquement par des molécules fluorescentes (vert pour didésoxyA, bleu pour didésoxyC, jaune pour didésoxyG et rouge pour didésoxyT)
• On sépare ensuite les fragments synthétisés dans un champ électrique (électrophorèse : les ADN sont des anions, ils vont donc vers le pôle +), en fonction de leur longueur (les plus petits vont plus vite).
• On lit ensuite les taches successives, identifiées par leur couleur, ce qui révèle la séquence des fragments synthétisés.

Le principe utilisé consiste donc à synthétiser toutes les copies partielles intermédiaires possibles de la molécule d'ADN. Cette synthèse est réalisée à l'aide d'un composé chimique fluorescent qui provoque l'interruption au hasard, mais systématique à la suite d'un seul des 4 nucléotides A, T, G ou C. On fait donc, en parallèle, 4 séries de copies. Dans chaque série, toutes les copies seront interrompues derrière un seul type de nucléotide ; par exemple, toutes les copies intermédiaires d'une série seront terminées par un A.
On sépare alors les copies selon leur taille par une migration électrophorétique dans un gel poreux. Ces gels permettent de séparer deux intermédiaires consécutifs qui ont une différence de taille d'un seul nucléotide. Il devient possible de reconstituer la succession des nucléotides tout au long de la séquence.

Technique chimique de Maxam et de Gilbert

La méthode chimique de Maxam et de Gilbert est moins utilisée actuellement que la méthode enzymatique de Sanger. L'ADN à séquencer est tout d'abord marqué en 5' avec phosphore 32 (dATP), puis clivé après A, G, C ou T par divers réactifs chimiques. Après clivage par ces réactifs, les fragments produits sont séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide. L'examen de l'autoradiographie correspondante permet de connaître la séquence du brin analysé.


Pour vous aider à mieux visualiser les différentes étapes du séquençage, nous vous proposons une animation. Pour démarrez, il vous suffit de cliquer sur Animation.