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  Les outils de génétique moléculaire
Le séquençage
Clonage positionnel

 
 
 

Introduction
Méthode qui utilise les techniques de cartographie et de séquençage, pour identifier un gène dont la mutation est responsable d'une maladie : travail de focalisation progressive qui, grâce aux cartes du génome, permet d'identifier et de réduire progressivement un intervalle contenant le gène muté. Une fois une telle région définie, on recherche les gènes qui y sont localisés et, parmi ceux-ci, lequel est responsable de la maladie.

Les étapes de l'identification d'un gène responsable de maladie par clonage positionnel :
McKusick (auteur de la base OMIM) a répertorié 5000 maladies monogéniques. On en comptabilise aujourd'hui environ 6800.
  • Tout être humain est porteur de 5 anomalies génétiques graves (qui ne s'expriment pas forcément).
  • Un enfant sur 100 naît avec une maladie génétique.
Identifier un gène responsable d'une maladie génétique, c'est localiser et définir la (les) mutation(s) à l'origine de celle-ci. Selon le cas, l'identification du gène peut s'effectuer de plusieurs manières différentes :
  • Par la voie biochimique
    Des indications relatives à la nature ou à la fonction de la protéine défectueuse peuvent permettre de remonter au gène présentant l'anomalie : on utilise alors la technique du clonage fonctionnel.
  • Par la voie cytologique
    Des observations cytogénétiques peuvent révéler des anomalies chromosomiques (délétions, translocations) qui peuvent guider les recherches vers une région précise du génome.
  • Par le clonage positionnel
    Si rien ne semble décelable au niveau biochimique ou cytologique, on utilise dans ce cas le clonage positionnel : la localisation de la région responsable de la maladie génétique étudiée s'effectue alors par analyse de liaison.
Le clonage positionnel procède par plusieurs étapes :
  • Recensement des familles au sein desquelles ségrège la maladie étudiée et extraction de l'ADN génomique du plus grand nombre d'individus de ces familles (atteints ou sains) à partir d'un échantillon sanguin prélevé sur eux.
  • Génotypage d'environ 200 à 300 marqueurs répartis à intervalles réguliers le long des chromosomes afin d'identifier ceux dont les allèles ségrègent spécifiquement avec le phénotype associé à la maladie : ces marqueurs définissent un intervalle de liaison au sein duquel se trouve le gène responsable.
  • La carte physique de la région impliquée est établie sous la forme d'un assemblage des YAC chevauchants
  • L'inventaire de l'ensemble des gènes présents sur cet intervalle (notamment à l'aide d'une recherche d'EST) est dressé, et parmi ceux-ci est recherché celui présentant des mutations qui ségrègent spécifiquement chez les individus malades.
L'examen prioritaire de tel ou tel gène candidat peut être privilégié par :
  • Le mode d'expression de la maladie ou sa parenté avec des gènes dont la fonction est connue.
  • L'existence de synthénies, c'est à dire, des groupes de liaisons conservés entre deux espèces, comme l'homme et la souris par exemple : un gène responsable d'un caractère donné identifié chez la souris a des chances d'être présent dans la région équivalente chez l'homme.
  • La détection de mutations passe alors par l'examen des séquences obtenues par Southern blot ou séquençage. La comparaison des séquences du gène chez les individus sains et les individus malades permet d'identifier la mutation responsable de la maladie.
    

© Université de Tours - NET - 7 janvier, 2008