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Les
plasmides (1/2)
Les plasmides sont des petits fragments d'ADN circulaire présents dans la
cellule bactérienne et indépendants du génome bactérien.
Propriétés générales des plasmides
Les plasmides présentent les caractéristiques suivantes :
- Leur ADN est bicaténaire, circulaire avec un
nombre de nucléotides inférieur à 10 kb (1 kilobase = kb = 1000
nucléotides).
- Le nombre de plasmides dans une cellule
bactérienne peut être considérable (plusieurs centaines).
- Les plasmides portent normalement des gènes
qui leur confèrent un avantage sélectif, par exemple une résistance à
un antibiotique.
- Leur réplication est indépendante de celle
du génome bactérien.
Préparation des plasmides
Les bactéries contenant les plasmides sont mises en culture dans un grand
volume (jusqu'à 2 litres de milieu de culture). Quand la concentration
bactérienne atteint une valeur suffisante, on traite par un antibiotique
(comme le chloramphénicol) qui empêche la croissance bactérienne sans
affecter la réplication des plasmides. On récupère les bactéries par
centrifugation. Puis, on perméabilise la paroi bactérienne par un
traitement doux permettant d'obtenir un passage en solution des plasmides
qui sont plus légers que l'ADN bactérien. La purification des plasmides
peut être ensuite réalisée par chromatographie liquide à haute performance
ou ultra-centrifugation en gradient de densité.
Préparation des plasmides pour la recombinaison, constitution de l'hybride
et transformation bactérienne :
L'insertion d'une séquence d'ADN bicaténaire dans un plasmide nécessite un
traitement préalable par une enzyme de restriction. On choisit une enzyme
qui a un site unique dans la séquence plasmidique. Après action de l'enzyme
de restriction, le plasmide circulaire est linéarisé. Pour maintenir la
linéarisation, il est indispensable de traiter le plasmide linéaire par une
phosphatase alcaline qui enlève les groupements phosphates en 5'. Le
plasmide linéarisé et traité par une phosphatase alcaline est ajouté au
fragment d'ADN à insérer en présence d'une ligase. L'ensemble de ces étapes
produit un plasmide recombinant.
Les bactéries peuvent être placées dans certaines conditions
physico-chimiques pour permettre aux plasmides d'être incorporés à
l'intérieur de celles-ci. Les bactéries traitées et prêtes à recevoir l'ADN
étranger sont appelées bactéries compétentes. L'incorporation des plasmides
dans les bactéries est appelée transformation bactérienne.
© 1999 Access Excellence
@the National Health Museum
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