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  Les outils de génétique moléculaire
Les techniques liées aux acides nucléiques
Détection, caractérisation et identification des acides nucléiques

 
 
  Marquage et suivi des acides nucléiques
Le marquage est principalement employé dans toutes les techniques qui utilisent une sonde (hybridation, Northern, ..). On distingue le marquage dit 'chaud' utilisant des isotopes radioactifs, et les marquages 'froids' qui utilisent des molécules aux propriétés fluorescentes, luminescentes. Ces dernières sont de plus en plus employées car plus pratiques.

Marquage radio-actif (1/2)

On distingue plusieurs méthodes selon la localisation du marquage (extrémités ou interne à la molécule) et selon la nature de la séquence marquée (simple ou double brin).
Le Phosphore 32 est le radioisotope le plus utilisé. Incorporé dans la sonde enzymatiquement au moyen d'un ou plusieurs nucléotides triP radiomarqués Il existe des sondes mono ou double brins Soufre 35, H 3 utilisés plutôt pour le séquençage et hybridation in situ. On peut aussi réaliser un marquage en 5' : avec la T4 polynucléotide kinase. La radioactivité est aussi utile pour le marquage des oligonucléotides de synthèse.

Les sondes double brins

Marquage par amorçage au hasard (Random Printing) :
Très employé dans les laboratoires pour par exemple les Southern et Northern Blot, il permet d'obtenir des activités spécifiques plus élevées, nécessaires pour détecter un gène sur quelques mG d'ADN génomique. Dans cette technique de marquage, les deux brins d'ADN de la sonde sont préalablement séparés par chauffage suivi d'un refroidissement brutal. Puis, on ajoute un mélange d'oligonucléotides (hexanucléotides) de synthèse correspondant à toutes les combinaisons mathématiquement possibles (soit 46 = 4096 nucléotides). Ces oligonucléotides vont s'hybrider avec le sonde pour une partie d'entre eux. Ces oligonucléotides fixés vont servir d'amorces au fragment de Klenow de l'ADN polymérase I qui va reconstituer l'intégrité des deux fragments en présence de désoxynucléosides triphosphates marqués au 32P. Des ADN polymérases par exemple dérivée du phage T7 sont actuellement les plus utilisées.

Marquage en 3' :
* avec une ADN pol. : fragment de Klenow, T4 ADN pol., Taq pol., transcriptase reverse.
* avec une exonucléase
* avec une terminal transférase
L'ADN peut être marqué à son extrémité 5' à l'aide d'une kinase, par exemple, la T4 polynucléotide kinase extraite d'E. coli infecté par le bactériophage T4. En présence d'ATP avec du 32P en position g ou [32P]g-ATP, il est possible d'échanger le groupement 5'-phosphate présent sur le fragment d'ADN avec le phosphate radio-actif en position g sur l'ATP. Cette méthode est générale. Elle est plus efficace si les extrémités 5'- sont préalablement déphosphorylées, par exemple par l'action d'une phosphatase alcaline.

Marquage par translation de coupure (Nick Translation) :
Utilisation de 2 enzymes :
* DNAseI dans des conditions ménagées pour générer quelques coupures simple brin dans le fragment d'intérêt
* DNA pol.I pour dégrader l'ADN dans sens 5'-3' au niveau de ces coupures et repolymériser en présence d'un nucléotide chaud.
Nous avons vu dans les outils enzymatiques utilisés en biologie moléculaire que l'ADN double brin traité par la Dnase I était clivé au hasard. La réparation des coupures réalisées par la Dnase I nécessite l'action de l'ADN polymérase I en présence de désoxynucléosides triphosphates marqués au phosphore radioactif (32P). Les désoxynucléosides triphosphates utilisés sont marqués en position alpha au 32P. Cette technique est appelée "Technique de Nick Translation". Cette technique est actuellement en retrait par rapport à la technique suivante.
   

© Université de Tours - 7 janvier, 2008