Sélection des bactéries transformées par des plasmides

Le taux de transformation des bactéries est généralement très faible. Il est fondamental de disposer de méthodes permettant d'obtenir des bactéries transformées par les plasmides et seulement celles-ci. Pour cela, l'artifice consiste à utiliser une résistance à un antibiotique (par exemple: l'ampicilline). La transformation d'une bactérie sensible à un antibiotique par des plasmides portant un gène de résistance au même antibiotique aboutit à l'apparition d'une résistance uniquement pour les bactéries ayant incorporé les plasmides.
Cette technique permet de séparer les bactéries comportant des plasmides et les bactéries sans plasmides car ces dernières sont tuées. Cependant, elle ne permet pas de distinguer les bactéries avec plasmides intacts des bactéries avec plasmides recombinants. On utilise pour cela une résistance à un second antibiotique, par exemple: une tétracycline.
L'insertion du fragment d'ADN dans le plasmide doit inactiver le gène de résistance au deuxième antibiotique. Les bactéries transformées par les plasmides recombinants sont donc résistantes au premier antibiotique (ampicilline) et sensibles au deuxième antibiotique (tétracycline). Les bactéries non transformées sont sensibles aux deux antibiotiques.

Un exemple de plasmide : le pUC19

Un plasmide classique est le pUC19. La séquence complète est connue (2686 nucléotides). Il comporte les particularités suivantes:
- Un gène de résistance à l'ampicilline (antibiotique). La présence de ce gène permettra à la bactérie porteuse de ce plasmide de ne pas être sensible à l'effet de cet antibiotique.
- Le gène lac Z qui code pour la b-galactosidase dans l'opéron lactose.
- Enfin, une région avec des sites multiples et uniques pour des enzymes de restriction connues. Cette région est appelée " polylinker ". Son rôle est de permettre l'insertion du fragment d'ADN étranger.

Commentaires sur le plasmide pUC 19 :
Ce type de plasmide est intéressant car il montre un système de sélection des bactéries ayant été transformées par les plasmides recombinants. Un système enzymatique appartenant à l'opéron lactose peut être utilisé à la place d'un second antibiotique. L'insertion du fragment d'ADN dans le plasmide pUC 19 aboutit à l'inactivation du gène qui code pour la b-galactosidase. Pour vérifier la présence ou l'absence de l'activité enzymatique b-galactosidase, on utilise un galactoside dont la couleur passe de l'incolore au bleu quand il est clivé par la b-galactosidase, ce composé s'appelle X-gal. Pour pouvoir métaboliser le X-gal, la cellule doit être exposée à un inducteur, cet inducteur est le IPTG (isopropylthio-b-D-galactoside).
En culture et en présence d'IPTG et de X-gal, les bactéries résistantes à l'ampicilline et transformées par les plasmides recombinants se présentent sous forme de colonies blanchâtres car elles ont perdu la capacité de clivage de l'équivalent coloré du lactose (le X-gal) par la b-galactosidase. Par contre, les bactéries résistantes à l'ampicilline et non transformées par les plasmides recombinants se présentent sous forme de colonies bleues. La sélection visuelle des bactéries transformées par les plasmides recombinants est donc possible.

Avantages et désavantages des plasmides

Avantages :
Petite taille du vecteur, permettant un travail expérimental aisé.
Sélection des plasmides recombinants (sélection par les antibiotiques).
Désavantages :
Faible efficacité pour la transformation des bactéries (pénétration de plasmides).
Impossibilité d'insérer des larges fragments d'ADN.