Types de coupures réalisées par les enzymes de restriction
Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures: la coupure à bouts francs et la coupure à bouts collants.
La coupure à bouts francs aboutit à une coupure au milieu de la séquence palindromique. La coupure à bouts collants (ou à extrémités adhésives) correspond à une coupure qui se fait de part et d'autre du centre de symétrie.
Les sites de restriction sont repérés dans l'ADN par l'enzyme de restriction qui coupe l'ADN en principe autant que fois qu'il y a de sites de restriction. Ceci est valable pour une enzyme de restriction donnée, pour une autre enzyme, la coupure se fera en une position différente sur l'ADN. On voit tout de suite les possibilités considérables de ce type d'outils enzymatiques. L'ADN est découpé en fragments variables et ceci aussi bien l'ADN circulaire des bactéries ou des plasmides que l'ADN linéaire.
 
Les classes d'enzymes de restriction
La plupart des enzymes de restriction utilisées au laboratoire présentent un site de reconnaissance (souvent palindromique) et un site de coupure identique ou proche du site de reconnaissance, ce sont des enzymes de type II. Certaines bactéries possèdent d'autres types d'enzymes de restriction. Les enzymes de type I reconnaissent des séquences sur l'ADN sans aucune symétrie. Ces enzymes coupent non pas au niveau de la séquence de reconnaissance mais 1000 à 5000 paires de bases plus loin. Les enzymes de type III présentent également un site de reconnaissance mais coupent une vingtaine de nucléotides plus loin.
 
Méthylation des sites de restriction et inactivation des enzymes de restriction
L'ADN bactérien présente des sites de restriction susceptibles d'être repérés par les enzymes de restriction que possèdent la bactérie. Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de modification de l'ADN bactérien interviennent. Ces enzymes de modification sont des méthylases bactériennes (ou enzymes de méthylation). La méthylation de la cytosine (sur le carbone 5) ou de l'adénine (sur l'azote 6) appartenant à des sites de restriction aboutit à une inactivation de l'enzyme de restriction correspondante. Cette méthylation peut se réaliser sur une base ou sur plusieurs bases appartenant au site de restriction. Les méthylases bactériennes sont très spécifiques.