Principe général
Cette approche, fortement tributaire de l'informatique, commence par découper de façon aléatoire le génome en différentes sections de longueur prédéterminée : 2.000 paires de base, 10.000 paires de base ou 50.000 paires de base. Des algorithmes mathématiques permettent ensuite d'assembler les fragments qui se suivent et de leur attribuer leur véritable emplacement sur le génome.

Les différentes étapes peuvent se résumer de la façon suivante :

• Découpage du génome en fragments qui sont insérés dans un vecteur (BAC, YAC, …).
• Cosmide ou BAC sous-cloné en fragments de petite taille
• Des clones prélevés aléatoirement sont séquencés
• Des séquences contigües sont reconstruites par recouvrement
• Les séquences restantes sont réalisées de façon dirigée.
  

On voit tout de suite que cette approche est problématique en présence de longues régions répétées.

Deux méthodes de shotgun pour le séquençage de génomes:

• Le shotgun "génome complet" (whole-genome shotgun) s'applique normalement aux génomes relativement simples, en exploitant au maximum les informations de cartographie et la bioinformatique pour éviter les misassemblages. Employé par Celera.
• Le shotgun hiérarchique ou "clone par clone" implique de générer un jeu de clones de grande taille (100-200kb) couvrant le génome puis de soumettre au shotgun uniquement des clones bien choisis. Ceci élimine les risques d'erreur "longue distance".