La fixation des sondes

Il existe deux méthodes pour "greffer" les sondes (dont on connaît la séquence) sur les plots :

• fixation d'oligonucléotides déjà synthétisés
  Ce mode opératoire permet de fixer des sondes relativement longues, atteignant 40 à 60 bases et s'effectue selon deux types d'adressage possibles :
  • par adressage mécanique, grâce à une micropipette robotisée
  • par adressage électrochimique : activation d'une microélectrode spécifique sur laquelle est réalisée une électro-polymérisation.
• synthèse in situ
  (Affymetrix par exemple). Dans ce cas, la construction des sondes se fait par dépôt de couches successives des quatre bases de l'ADN sur un support en verre. C'est un masque lithographique, dont la configuration varie à chaque dépôt d'une couche, qui permet aux bases de s'empiler correctement. Avec ce procédé, les sondes comportent au maximum 30 bases. Ce procédé permet de fabriquer indifféremment telle ou telle sorte de biopuce. L'adjonction successive de bases à la sonde s'effectue par adressage photochimique.

L'hybridation sonde-cible

Une séquence d'ADN cible est marquée par fluorescence (fluorochrome devenant fluorescent lorsqu'il est excité par un faisceau lumineux) et préparée en solution et mise en contact avec la biopuce.
Le rôle de chaque sonde est de reconnaître, dans le mélange appliqué à la surface de la biopuce, cette séquence d'ADN cible. La phase d'hybridation est réalisée dans une sorte d'incubateur (station fluidique) et suivie d'un lavage destiné à débarrasser la puce des cibles nucléiques non hybridées.

La détection des hybridations

Il s'agit ici de déterminer les sondes qui ont été effectivement hybridées, c'est à dire de repérer à quelles adresses les sondes sont complémentaires des cibles de l'échantillon test. Une lecture optique permet de révéler les sondes d'ADN devenues fluorescentes (hybridées avec les cibles marquées). Les données récoltées sont analysées par un logiciel-traitement d'images.
L'utilisation de 2 fluorochromes différents permet la détermination des signaux d'hybridation de deux sondes distinctes au cours d'une seule expérience.