Le clonage va permettre d’insérer dans un vecteur le fragment d’ADN amplifié lors de l’étape de PCR. Cette étape de clonage est indispensable pour la réalisation d’analyses ultérieures en particulier le séquencage.

Votre stratégie de clonage sera la suivante :
1/ préparation de l’insert : purification de l’ADN issu de la PCR soit par électrophorèse soit par chromatographie (içi une chromatographie d'exclusion).

2/ préparation du vecteur (exemple du vecteur PGEM-Tavec le gène rapporteur B_gal et le gène de résistance à l’ampiciline : schéma vecteur ).

On utilise içi un plasmide comme PGEM-T qui adapté au clonage des produits de PCR. La polymérase ajoute généralement un A à la fin des fragments synthétisés lors de la PCR et on utilise cette propriété en utilisant des vecteurs ouverts qui présentent un T en 3' de chaque brin. La ligation se fait dircetment T et A ensemble.
3/ Quantité vecteur et insert : on met un rapport 1/1 de l’un et de l’autre avec une quantité de 0.05 µg de plasmide. Différents rapports sont possibles dont ce rapport 1/1.

4 / ligation des inserts et des vecteurs
L'étape de ligation est essentielle pour que le plasmide puisse être introduit durablement dans la bactérie hôte.Elle se fait en présence d'une ligase.

5/ transformation de bactéries, généralement E.coli.
De nombreuses souches sont disponibles et utilisées selon le type de clonage.
6 /sélection des colonies transformées sur milieu contenant de l’ampicilline (ou un autre critère sélectif suivant le vecteur utilisé) et les éléments nécessaires au système rapporteur B-gal.

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Document modifié le 17 juillet, 2017